双向电泳仪原理(双向电泳的步骤和原理)

本文由吉康医学研究院王亚军博士撰文

双向电泳仪原理(双向电泳的步骤和原理)

在生物体的细胞器、细胞和组织中,各种复杂的生理功能和代谢反应都由蛋白质所维持。蛋白质与基因组序列信息之间,并非“一一对应”的关系。转录后加工、翻译调节及翻译后加工等过程使得生物体总蛋白质数目远远超过有活性的基因数目。因此,蛋白质组 (proteome) 的概念应运而生。蛋白质组是指由在特定的生理、病理条件下一个基因组或一个细胞/组织表达的所有蛋白质。功能基因及其产物的鉴定、分离都需要高效、高分辨率、微量样品的分析鉴定技术,双向电泳和质谱联用已经成为相关实验室的常用研究手段。随着功能基因组时代和蛋白质组时代的到来,双向电泳技术 (Two-dimensional Electrophoresis)已经成为生物学研究的核心技术之一。

双向电泳技术基本原理1975年,意大利生化学家O’Farrell发明了双向电泳技术。它是利用蛋白质的带电性和分子量大小的差异,通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质组的技术(图1)。第一向电泳依据蛋白质的等电点不同,通过等电聚焦将带不同净电荷的蛋白质进行分离。在此基础上,依据蛋白质分子量的不同进行第二向的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,将其分离。双向电泳技术包括蛋白样品制备、等电聚焦、在平衡液中平衡胶条和SDS-PAGE电泳等步骤。

图 1 双向电泳操作示意图

双向电泳技术的具体步骤

1蛋白质样品的制备

样品制备是双向电泳的第一步,其成功与否决定双向电泳成败的关键。由于双向电泳所分析样品的多样性,没有一种通用的制备方法适用于各种样品。但有几条共同的原则需要遵循:

(1)尽可能溶解全部蛋白质,打断蛋白质之间的非共价键结合,使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在;

(2) 避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用;

(3)避免脂类、核酸、盐等物质的干扰作用;

(4)蛋白质样品与第一向电泳的相容性。对于组织细胞,首先需将其破碎,尽可能地将蛋白质组分溶解在缓冲液中,以便在适当的电泳条件下分离。组织细胞破碎的方法包括低渗、匀浆、超声、反复冻融等。而对于体液成分,如血清、腹水、尿液等,仅需经过稀释、加热变性、溶解于适当缓冲液便可用于双向电泳。在制备蛋白质样品的过程中,最好使用Dnase和RnaseA来降解核酸。如果蛋白质样品中含有较多的核酸,会增加样品的粘性并造成非斑点处的背景拖迹,甚至还可能封闭凝胶孔。在蛋白样品裂解时,应以溶解尽可能多的蛋白质和保持在整个双向电泳过程中蛋白质的溶解性为主要目标。对于水溶性蛋白,PBS和Tris缓冲液即可将其完全溶解 ,然而细胞中还有大量的疏水性蛋白(如膜蛋白),很难溶于常规的缓冲液,因此增加疏水性蛋白的溶解度一直是很多学者奋斗的目标。目前增加蛋白质溶解性的方法主要是使用变性剂,如尿素、硫脲,可以打破蛋白质的高级结构,打断非共价连接。据报道,硫脲不仅对蛋白质有增溶效果,还有抑制蛋白酶活性的作用。去污剂,如阴离子去污剂SDS、非离子去污剂 NP-40、TritonX-100、两性离子去污剂 CHAPS、SB3-10,可以打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用,增加蛋白质溶解性,其中只有非离子型和两性离子型适于双向电泳。带有 12~16个碳原子烷基侧链的氨基硫代内铵盐,如 SB-10、CABS14、ABS16 等,与尿素和硫脲同时使用,对膜蛋白的增溶作用更为突出。最近的研究显示,非离子去垢剂十二烷基麦芽苷和十六烷基乙二醇(decaethyleneglycol mono hexadecyl )对疏水性蛋白的增溶效果也非常明显。还原剂可以打开二硫键,并在随后的操作中保持蛋白质处于还原状态,如二巯基苏糖醇(DTT)、磷酸三丁酯(TBP)、羟乙基二硫化物(HED)。TBP 为非离子型还原剂,在较低浓度下(3~5 mmol/L)即可提高蛋白质溶解性,而且不会在电场中迁移,等电聚焦过程中可始终维持蛋白质的还原状态,同时简化了两向转移间的平衡操作。但由于TBP 溶解度有限且在溶液中不稳定,在溶胀和聚焦过 程中补充适量DTT是有帮助的(常用浓度为2 mmol/L TBP和65 mmol/L DTT)。用0.5 mol/L DTDE或100 mmol/L HED替代DTT也会提高碱性蛋白质溶解性获得很高的分辨率,同时简化了平衡操作。虽然含有变性剂、去污剂 和还原剂的裂解液在很大程度上增加了蛋白质溶解性,但在聚焦时仍有一些蛋白在其等电点附近发生沉积。研究表明,一些蛋白质溶解需要一定的盐浓度,可是高浓度的盐离子不仅限制电压升高,延长了聚焦时间,所形成的高电流会引起凝胶过热甚至烧坏,所以样品缓冲液中盐浓度不能超过 40 mmol/L。而两性电解质在一定程度可以缓解盐离子浓度低的问题,且具有在聚焦过程中不改变 pH 梯度前提下提供稳定电导的能力。二次样品制备的目的是去除干扰双向电泳的非蛋白物质(如盐、酚类物质、脂类、多糖和核酸等)和阻止在双向电泳谱中导致假点的多肽或蛋白修饰。

2 第一向电泳

第一向是等点聚焦电泳,等点聚焦是20 世纪60年代建立的蛋白质分离技术,基本原理是利用蛋白质或其它两性分子等电点的不同,在一个稳定的、连续的 pH 梯度中进行分离和分析。IEF 具有分辨率高(0.01pH 单位)、 抵消扩散作用、可使浓度较低的样品达到高度浓缩等优点,不仅可以用来分离两性大分子,还可以通过测定等电点来鉴定蛋白质。根据建立 pH 梯度的原理不同,可以分为载体两性电解质pH 梯度(Carrier ampholytes pH gradients)和固相 pH 梯度(Immobilized pH gradients)。前者是在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度,后者是将缓冲基团作为凝胶介质的一部分,分辨率比前者提高一个数量级。根据电泳方式的不同,IEF 可分为管状、薄层、垂直和水平等点聚焦。目前广泛应用的是IPG水平等点聚焦, Amersham Biosciences 公司的 MultiphorII 和 IPGphor系 统,Bio-Rad 公 司 的 PROTEAN IEF Cell 都为水平等点聚焦提供了良好的平台,是目前双向电泳首选仪器。IEF 运行程序和参数的设置须根据 pH 范 围 和 IPG 胶 条 长 度 而 定。另外,由于样品蛋 白质组成存在差异,IEF运行条件应因样品而定。聚焦完成后,胶条既可以在中间电压 500~1 000V下短时间保持,便于随时进行第二向的平衡,也可以置于-80℃冰箱中进行长期保存。

3第二向电泳

第二向是十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS – PAGE),在恒温下进行,胶条由一向转移到二向前,要在平衡液中平衡30分钟,使胶条浸透SDS缓冲液,平衡液使固相pH梯度胶条的pH适合第二向电泳,并防止电内渗,以及提高蛋白质从一向到二向的转移效率。一般采用 1.5~1mm 厚的聚丙烯酰胺凝胶,进行 5~8 小时左右。起始时用低电流或低电压 , 样品在完全走出一向胶条时 , 再加大电流(或电压),待指示剂达到底部边缘时即可停止电泳,进行染色。目前实验室最常用的显色方法是考马斯亮蓝染色和银染,也有荧光染色,同位素标记,负染法等。

4 图像分析与鉴定

成像设备可以摄入图像,对凝胶图像以数字形式保存,对每块凝胶图像进行平等的比较,在各研究组之间传递信息,并对大量的数据进行归类分析。目前应用较为广泛的图像分析软件有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator 等,分辨率较高,功能齐全。尽管如此,仍不可避免约10%的未检出点和假点,需要手工添加、删除和分割。图像采集完成后,可以应用各种分析软件进行分析可以收集、诠释、比较蛋白质组数据资料等。一旦通过差异分析或其它方法找到感兴趣的蛋白后,就可以从凝胶中或膜上切取这些目标蛋白质作鉴定。现在绝大多数蛋白质的鉴定是通过质谱分析来完成的。

双向电泳在蛋白质组学研究中的应用双向电泳的分辨率较高,自第一次应用该技术以来,其分辨率已从15个蛋白质点发展 到 10000 多个蛋白质点。一般的双向电泳也能分辨1000~3000个蛋白质点。因此,近年来,双向电泳被广泛应用于动物科学、医学等研究领域。双向电泳是目前分离复杂蛋白质混合物的最强有力的方法,从很多方面来说,其是最直接寻找和预分离未知蛋白及其翻译后修饰形式 (post- translationally modified forms , PTMs) 的方法。1 作为监测基因表达的工具双向电泳正是获得蛋白质整体表达情况的工具,同时还可用于展示基因的差异表达情况。双向电泳方法与生物质谱技术的不断进步,以及两者有效的结合,使研究人员能够更加有效地分离蛋白质复杂混合物、显示蛋白质差异以及随后鉴定这些蛋白质。2 鉴定细胞器组成线粒体或细胞核 (nucleus) 等浓缩的细胞器浸液可通过超速离心等一系列步骤获得 , 用双向电泳分析。因此,能在单个实验中分离多种细胞器特有的蛋白质。但由于生化分离过程尚不够完善,双向电泳所呈现的蛋白质并非来自某一种细胞器,可能混杂了其它蛋白。3 新陈代谢和毒理学的研究双向电泳监测蛋白质表达的整体变化,通过对重组蛋白质生成的连续监测,进行生物工程中细胞株生长的质量控制。双向电泳也可用于检测药物对细胞株蛋白质表达的影响。通过密切监测药物治疗后蛋白质表达的变化,可以获得药物作用机理、药物细胞毒性等信息。4 分析简单有机生物体的整体蛋白质组应用双向电泳研究简单生物体的系统已经较完善,有可能推广使用。简单有机生物体的基因组复杂性较低,可得到的样本量不受限制。另外,比较致病菌株和非致病菌株以及测试其药物反应对科学研究也有重要价值。5 免疫印迹法———Western blot和Far – Western blot根据固定在纤维素膜上的蛋白质仍能结合抗体来特异识别抗原决定簇的原理,临床上用于患者血清的免疫印迹来发现新的变态反应原,再通过双向电泳分离分析。虽然目前并非所有蛋白质的量都能达到质谱的检测范围,但这种方法阐明了其单个实验检测大量磷酸化蛋白质的能力。由于其较高的灵敏性和特异性,即使在蛋白质组学的概念出现之前,免疫印迹法就已得到广泛的应用。利用Western Blot 和 Far – Western Blot方法,将标记的蛋白、蛋白结构域或多肽与膜杂交,通过荧光等直接标记方法或其它间接方法检测它们与膜的结合,从中发现的目的蛋白可以再进行质谱分析鉴定。双向电泳在医学中的应用

目前许多研究者利用双向电泳对人体的各种组织、器官、细胞进行了研究,为疾病的诊治及了解发病机制提供了新的手段。例如,在肿瘤的研究中,寻找与肿瘤发生、发展和抗药性有关的蛋白,Wu等利用表面加强激光解吸电离(surface-enhanced laser desorption/ ionization,SELDI)蛋白芯片技术进行双向电泳和质谱分析(MS),鉴定了来自同一患者的两个头颈部鳞状细胞癌细胞系UMSCCIOA和UMS CCIOB中差异表达的蛋白。Srisomsap 等利用双向电泳研究了甲状腺组织(包括正常甲状腺、多结节性甲状腺肿、弥散性增生、滤泡性腺瘤、滤泡性癌和乳头状癌)的蛋白表达模式。对特定蛋白通过 ESI-MS 和蛋白测序进行鉴定。结果发现一个最显著的蛋白-组织蛋白酶B(CB),它在不同的甲状腺疾病中的表达不同。与非肿瘤性甲状腺疾病相比,这些组织蛋白酶 B 的蛋白点中CB2 和 CB3 在甲状腺肿瘤中明显上调。苏坚采用二维电泳、图像分析、质谱技术等方法在相同条件下,对二烯丙基二硫(DADS)处理前后SW480细胞两种样品的总蛋白质进行双向电泳,其中167个匹配的蛋白质点存在表达量上的差异。与对照组相比,处理组蛋白质表达量下调的有 69 个,利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDITOF-MS)对其中8个表达明显下调的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得相应的肽质量指纹图谱(PMF),通过数据库搜索,确定了这8个蛋白,这些差异蛋白质涉及细胞周期调控、细胞分化、细胞凋亡及细胞分裂增殖等众多事件。因此说明,DADS 可能具有抑制结肠癌细胞生长,阻滞细胞周期,诱导细胞分化及凋亡的作用。利用双向电泳技术建立和优化了人血清蛋白质图谱,为进一步开展疾病的血清蛋白质组学研究奠定基础。另外双向电泳还应用在临床诊断、理研究、药物筛选、新药开发、食品检测、甚至物种鉴定等方面。

目前双向电泳技术尚未完善,手工操作较多,经验性强,且存在许多局限性。尽管如此,该技术目前仍然是蛋白质组研究中不可替代的分离方法,随着蛋白质组学的兴起,对技术有了新的要求和挑战。近年来,双向电泳凝胶图像分析软件正向高分辨率、高灵敏度、自动化、智能化的方面发展,这将对整个蛋白组学的研究起到积极的推动作用。

双向电泳作为蛋白组学研究的必要工具之一,该技术已被广泛应用到研究细胞生物学、神经生物学等各种学科领域,其研究对象覆盖了原核微生物、真核微生物植物和动物等范围。目前,蛋白质组研究已涉及多种重要生物学现象,信号转导、磷酸化蛋白、细胞分化、蛋白质折叠、细胞内蛋白质相互作用。

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